Inter-bacterial mutualism promoted by public goods in a system characterized by deterministic temperature variation
变温生态系统中代谢产物共享促进细菌互利共生
第一作者：赵宇翔
通讯作者：胡宝兰
期刊：Nature communications
影响因子：16.42
DOI：10.1038/s41467-023-41224-7
文章摘要
互利共生是物种相互作用中参与双方双赢的一种互作方式。尽管在自然界中经常观察到物种间的互利共生，但在细菌群落中却很少被观察到。非生物压力被推测是促进细菌互利共生的关键，但受到自然生境细菌群落无法连续和重复观测以及人工群落普适性较低等因素的限制，解析非生物压力下细菌互利共生关系较为困难。因此，在合适的生境中探索非生物压力如何影响细菌互利共生是非常重要的。堆肥是一个半自然、半密封、可连续及重复观测的变温生态系统，其中温度是最主要的非生物压力（20℃-70℃）。此外，由于温度变化是由微生物代谢所导致，堆肥群落也不会在温度的变化下发生崩溃。因此，堆肥是探究非生物压力如何影响细菌互利共生的最佳生境。高通量、宏基因组、宏转录组和纯菌培养结果表明，堆肥高温压力会增强细菌互利共生关系，且高温会定向选择Thermobifida fusca和 Saccharomonospora viridis这类生长缓慢但耐受压力的物种，它们会通过共享钴胺素促进其他细菌生长。3000组细菌对的培养研究表明，在含有Thermobifida fusca和 Saccharomonospora viridis的细菌对中互利共生关系占比较高（约为39.1%），竞争关系则较少（13.9%）。综上，本研究证实了非生物压力对于互利共生的促进作用，并揭示了高温如何定向选择生长缓慢的物种，使其在群落和物种水平上有利于互利共生并抑制种间竞争。
1、温度对互利共生潜力的影响
不同统计学方法表明，在本文所研究的温度变化范围内，温度升高可以增强潜在种间合作关系（Fig. 1a-c 和Note 1-3 in SI）。本研究进一步通过样本内相对丰度、样本间相对丰度、出现频率及与细菌合作潜力识别了3个ASVs为ACT ASVs。这3个ASVs都隶属于Actinobacteria，其中2个ASVs隶属于Thermobifida fusca，1个ASV隶属于Saccharomonospora viridis（Fig. S19-S22和Text S4.1 in SI）。ACT ASVs 和邻居 ASVs（与 ACT ASV 直接相连的 ASVs）间的子网络表明，23 个邻居 ASVs（71.9%）与 ACT ASVs 呈正相关（Fig. 1f 和Supplementary Data 4）。其中 68.8%以上隶属于堆肥主要的功能物种Firmicutes（Fig. 1f和Fig. S23 in SI）。
为进一步确定ACT ASVs在高温下的生存策略（快速生长的富营养型或生长缓慢但高效的寡营养型），本文对每个ASVs的核糖体拷贝数和每个样本的丰度加权核糖体拷贝数进行了评估。结果表明，高温会选择生长较慢的微生物，ACT ASVs是其中的代表（Fig. S24-S26和Table S5-S6）。与ACT ASVs相反，邻居ASVs具有较高的rrn拷贝数，是快速生长的细菌，且与堆肥功能高度相关（Fig. S25）。因此，高温可能有利于生长速度较慢的物种，这些物种（即 ACT ASVs）可能会与其他生长速度较快的物种合作，促进堆肥功能。
图1 温度和微生物潜在合作关系变化
2、细菌群落组成和转录活性
根据不同的堆肥阶段，将 60 个样本合并（根据取样时间将10个样本混合为1个样本），共得到6个合并样本以用于宏基因组和宏基因组测序。经binning后，共获得 467 个宏基因组组装基因组（MAGs），其中159个MAGs高质量MAGs被用于后续分析（Supplementary Data 5和 6）。其中，48.4%属于Firmicutes，其次是Proteobacteria（25.2%）和Actinobacteriota（10.7%）。同时，还获得了 30 个近乎完整的 MAGs（完整度大于 98%），其中两个（即 MAG73 Thermobifida fusca 和 MAG406 Saccharomonospora viridis）与 ACT ASVs 属于同一物种。在第0天，MAG73 和 MAG406 的相对丰度和转录活性均小于 0.0001%。随后，它们的相对丰度和转录活性在第5天达到峰值（37.4%，51.4%），随后是第12天（30.8%，36.8%）和第20天（23.9%，24.9%）（Fig. 2）。综上，结果表明在平均温度超过50℃的第5天、第12天和第20天，Thermobifida fusca和 Saccharomonospora viridis可能具有重要作用。
图2 高质量MAGs系统发育树
3、代谢互作分析
每个MAGs中的基因都依据 KEGG Orthology（KO）进行了注释，并根据模块完整性分为7个组（Fig. S28和Fig. S29 in SI）。我们重点关注了与氨基酸（24个模块）、维生素和辅助因子（18个模块）以及脂质和脂肪酸合成（28个模块）相关的代谢物合成模块。结果表明，只有MAG73 Thermobifida fusca 和 MAG406 Saccharomonospora viridis所属的组VI有独特的代谢模块（2个）（Fig. 3a），且均与钴胺素有氧生物合成有关（Fig. 3b）。基因和转录水平也证实了堆肥细菌群落中钴胺素供需关系的不平衡（Fig. 3c-f）。只有MAG73 Thermobifida fusca 和 MAG406 Saccharomonospora viridis完整编码并转录了完整的钴胺素合成路径，而超过96.2%的微生物编码了钴胺素依赖型基因，暗示了其可能通过共享钴胺素与其他微生物合作。此外，超过83.3%编码纤维素降解酶和氮循环相关功能的基因的隶属于Firmicutes的MAGs都编码了钴胺素依赖性基因（Fig. 3g-h）。因此，考虑到高温条件下Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis较高的丰度和转录活性，以及它们独特的钴胺素合成能力，这些物种可能会分享钴胺素作为公共物品，与Firmicutes合作。
图3 堆肥过程钴胺素合成和需求
4、细菌种间互作方式
本研究以Sphingomonas paucimobilis、Lactobacillus brevis和Idiomarina andamanensis（高丰度非ACT ASVs）为对照组，验证了Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis对Firmicutes（40 个种）的影响。研究结果证实了核心物种通过分泌钴胺素促进厚壁菌门细菌生长。受测Firmicutes菌株上清液中的钴胺素浓度明显下降（降幅近 90%，Fig. S33a）。相较对照组细菌，仅有Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis会往胞外释放钴胺素（750.6 μg/L），且能促进Firmicutes菌株16S rRNA基因拷贝数提升3.6倍（Fig. 4a）。为了确认其他代谢物是否也呈现出钴胺素所观察到的模式，我们用核黄素作为对照，因为核黄素和钴胺素一样，也是一种生物合成维生素。结果与钴胺素的结果完全相反，所有受测物种都能分泌核黄素（Fig. S34 in SI）。综上，结果表明Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis通过分泌钴胺素促进Firmicutes生长。
为了进一步验证共培养下细菌间互作模式，本研究分别在不同温度（37℃和 50℃）和培养基（LB培养基和垃圾渗滤液）等条件下共培养了对照组、关键组和Firmicutes（Fig. 4b和Supplementary Data 10）。研究结果表明Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis与Firmicutes细菌之间形成了稳定的合作关系（31.0%-44.6%），比对照组细菌高2.8-4.0倍，且不受培养基变化的影响，表明核心物种在促进功能物种生长的基础上可以有效应对底物的变化（Fig. 4c-d）。综上所示，互利共生关系在高温下达到顶峰，并可通过Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis分泌钴胺素而增强。
图4 纯菌微生物互作
总 结
综上，本文证实了以确定性温度变化为主的生态系统中互利共生的普遍存在。本研究也提出高温会选择生长缓慢的微生物，而这类微生物可能会通过共享代谢产物促进互利共生。在工程应用方面，几乎所有的工程生境都面临着非生物压力，微生物群落对环境的适应是一个值得关注的问题，同时培养成千上万种微生物难以实现，但关注某类能促进互利共生的物种实现群落的定向调控，可能是一种有效的解决策略。