Methane-dependent complete denitrification by a single Methylomirabilis bacterium一株Methylomirabilis细菌独立介导的全程反硝化型厌氧甲烷氧化。

第一作者：姚翔午

通讯作者：胡宝兰

期刊：Nature Microbiology

影响因子：28.3

DOI：https://doi.org/10.1038/s41564-023-01578-6

文章摘要

厌氧生境中，甲烷氧化耦合硝酸盐/亚硝酸盐还原往往被认为由ANME-2d古菌和Candidatus Methylomirabilis细菌共同参与完成。本研究经过1000多天从稻田土壤中富集分离得到一株厌氧甲烷氧化细菌Ca. Methylomirabilis sinica（M. sinica），并首次证实了该菌独立催化的全程反硝化型厌氧甲烷氧化过程（5CH₄ + 8NO₃− + 8H+ → 5CO₂ + 4N₂ + 14H₂O）。同位素标记实验表明，该菌在氧化甲烷的同时，可将硝酸盐经过亚硝酸盐还原为氮气，且该过程符合化学计量理论比值。宏基因组结合转录组和蛋白组的多组学联用，证实该菌编码并活跃表达了包括硝酸盐还原酶Nap在内的参与完整反硝化耦合甲烷氧化的代谢功能酶。反应动力学结果表明，M. sinica对硝酸盐的基质亲和力高于ANME-2d古菌在内的大部分反硝化菌，而这也暗示了该菌在氮素缺乏的寡营养生境具有较强的生态竞争力。本研究的发现打破了“两步式”反硝化型厌氧甲烷氧化的传统概念，通过公共数据库的比对发现，M. sinica在全球自然生境中广泛存在，这预示着该全新的生化过程可能会对全球甲烷和氮素循环产生重要影响。

主要结果

1、Candidatus Methylomirabilis细菌的富集培养

为探寻全程反硝化型厌氧甲烷氧化微生物，本研究以富含甲烷和硝酸盐的中国杭州某稻田缺氧土层作为富集源，利用气升式序批反应器（GLSBR）进行长达380天的富集培养。富集体系中仅供应硝酸盐和甲烷分别作为电子受体和电子供体，最终获得了以Methylomirabilis细菌为主导的富集培养物。经过近400天的运行，反应体系中硝酸盐的去除速率从0.16 ± 0.01增加到65.78 ± 4.60 μmol l^-1 h^-1（图1a）。高通量测序结果表明，Methylomirabilis细菌的相对丰度从富集源中的2.6%增加至第380天时的73.5%。此外，Methylomirabilis细菌的丰度也从1.10×107增加到3.21×1012 copies g^-1（16S rRNA基因拷贝数）（图1a,b），该丰度结果也通过荧光原位杂交（FISH）镜检得到再次证实（图1c-d）。值得注意的是，ANME-2d古菌在整个反应器运行过程中几乎检测不到，这可能是由于反应器中存在的微量氧气致使Mcr失活从而抑制了ANME-2d古菌的生长，而对于利用甲烷单加氧酶（pMMO）的Methylomirabilis细菌来说，微量氧气对其几乎没有负面影响。

图1  富集分离过程中Candidatus Methylomirabilis细菌丰度活性的动态变化

2、富集培养物的宏基因组分析

为进一步探究该富集菌株的代谢潜力和系统发育地位，本研究将富集阶段的培养物进行了宏基因组测序，并通过分箱操作获得了34个高质量的拼接基因组（MAGs），其中就包括了一个隶属Methylomirabilis属的基因组MAG359。进一步，通过基因组分析结合Sanger测序得到该菌株的16S rRNA基因全长序列，比对后发现该菌株与本课题前期命名的M. sinica相似度高达99.4%，从而确定了该菌株的系统发育地位。与其他Methylomirabilis细菌类似，M. sinica（MAG359）编码了从硝酸盐到亚硝酸盐、一氧化氮再到氮气的完全反硝化所需的所有基因，包括周质空间型硝酸盐还原酶NapAB、细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶NirS和一氧化氮歧化酶Nod编码基因。此外，为了进一步明晰M. sinica在系统发育层面与其他Methylomirabilis细菌的差异，本研究分别基于基因组以及代表性功能基因napA和pmoA的氨基酸序列进行系统发育树构建（图2）。结果表明，M. sinica与目前已知的Methylomirabilis细菌存在一定系统发育学距离，预示着该菌株很可能具备不同的代谢潜力。

图2  Ca. M. sinica基因组以及功能酶的系统发育树

3、由Ca. M. sinica独立完成的全程反硝化型厌氧甲烷氧化

由于富集物中存在其他微生物的干扰，因此，为了更加精准地证实M. sinica是否具备独立催化全程反硝化型厌氧甲烷氧化反应的能力，本研究在高纯富集物的基础上，通过单细胞分选结合梯度稀释培养法，最终在第1330天时获得该菌株的纯化培养物（图1b,e,f）。随后，本研究利用纯化培养物进行同位素培养实验，结果表明，在培养体系中几乎所有被消耗的13CH₄均转化为¹³CO₂（图3a），且M. sinica几乎也将所有¹⁵NO₃-按化学计量比还原为³⁰N₂（图3b）。基于化学计量衡算发现，在纯化培养体系中，¹³CO₂和³⁰N₂的生成速率分别为0.251 ± 0.002 μmol h^-1和0.199 ± 0.012 μmol h^-1，其比值（r¹³CO₂/r³⁰N₂）为1.263 ± 0.066，非常接近理论化学计量比1.25（图3c）。值得注意的是，通常情况下，在由甲烷或丙烷驱动的全程反硝化的微生物体系中，由于不同微生物间的协同代谢，亚硝酸盐常会作为中间产物在胞外积累。而本研究中，在整个反应过程中均未检测到中间产物¹⁵NO₂-的胞外积累。此外，在对照组中，¹³CH₄和¹⁵NO₃均无法单独被消耗。至此，本研究证实了由M. sinica独立执行的全程反硝化型厌氧甲烷氧化过程。

图3  全程反硝化型厌氧甲烷氧化反应中同位素标记的化学计量衡算

4、Ca. M. sinica中关键功能基因的表达情况

为进一步揭示M. sinica催化全程反硝化型厌氧甲烷氧化的代谢机制，本研究继续利用转录组和蛋白组等方法对M. sinica中关键功能酶的表达情况进行解析。转录组的结果表明，富集物中M. sinica对硝酸盐还原的贡献度达54.4 ± 1.2%，对亚硝酸盐还原的贡献度达70.9 ± 4.0%，而对最终氮气生成的贡献度则达到了79.4 ± 11.2%。有趣的是，在纯化培养物中，nap基因的转录水平高于nir基因，这是在以往研究中从未被报道过的现象，说明M. sinica具有较强的硝酸盐还原能力（图4a）。此外，虽然也检测到传统的一氧化氮还原酶基因的转录，但其转录水平远低于一氧化氮歧化酶nod，这也与最终氮气的生成现象相互支撑（图4a）。蛋白组的结果表明，富集物中M. sinica对硝酸盐还原、亚硝酸盐还原和氮气的生成均有较高的贡献度，分别达到了70.9 ± 8.8%、78.4 ± 10.3%和100 ± 0%。此外，在纯化培养体系中也检测到了高丰度的反硝化和甲烷氧化功能酶（图4b）。与转录组结果类似，其中Nap的表达水平同样高于Nir，且仅检测到了高丰度Nod的存在，而几乎检测不到传统一氧化氮还原酶的存在（图4b）。

图4  Ca. M. sinica中关键功能酶的表达热图

5、全程反硝化型厌氧甲烷氧化的反应动力学

为进一步探究为何该菌株“选择”硝酸盐作为电子受体，本研究继续利用纯化培养物进行反应动力学实验以测定M. sinica对不同底物（NO₃-和NO₂-）的亲和力。基于米氏方程分析可知，M. sinica对NO₃-的半饱和常数K_m为10.5 ± 0.9 μM，硝酸盐还原最大速率为88.7 ± 8.7 μM h^-1 g^-1（图5a）；M. sinica对NO2-的半饱和常数Km为15.3 ± 0.9 μM，亚硝酸盐还原最大速率为156.8 ± 7.2 μM h-1 g-1（图5b）。K_m是微生物基质亲和力的重要衡量参数，而基质亲和力又是微生物重要的生理特性，对其生长代谢和生态位竞争都有重要的影响。虽然M. sinica对NO₂-的半饱和常数达到μM级别，但较其他NO₂-利用者，M. sinica可能不具备相应的竞争力。通过对比NO₃-的亲和常数发现，M. sinica对NO₃-的亲和力比DAMO古菌和大部分传统的反硝化菌更强。该结果表明M. sinica可能会利用更高的硝酸盐亲和力在自然生境，特别是低硝酸盐含量的寡营养生境获得更强的竞争优势。

上述推测也在寡营养（5 μM NO₃-/NO₂-）和富营养（500 μM NO₃-/NO₂-）模拟培养中得到验证：在营养充足的条件下，无论是NO₃-还是NO₂-均能促进M. sinica的生长，且NO₂-的存在可使M. sinica生长更佳（图5e,f）；而在仅提供5 μM NO₃-的条件下，虽然M. sinica的16S rRNA基因的拷贝数轻微降低，从1.33×10¹¹降至1.29×10¹¹ copies g^-1，但其相对丰度从40.3%上升至55.6%（图5c,d）。该结果证实了具有更高硝酸盐亲和力的M. sinica在氮素缺乏的寡营养生境中具有更强的适应力和生长优势。

图5  反应动力学揭示Ca. M. sinica对硝酸盐和亚硝酸盐的亲和力差异及其在寡营养环境中的竞争优势

6、Ca. M. sinica的潜在生态意义

最后，为进一步揭示M. sinica潜在的生态分布和生态意义，本研究将该菌16S rRNA基因的全长序列在NCBI的SRA库中进行比对搜索后，进行全球地图绘制，发现M. sinica广泛分布于全球各类生境，包括淡水、湿地、土壤及海洋等生境，其中相对丰度最高可达5.9%。上述结果暗示了M. sinica介导的全程反硝化型厌氧甲烷氧化反应是一个全球广泛分布但以往被忽视的碳氮循环新过程。

总  结

本研究针对厌氧甲烷氧化菌富集分离的难点科学问题，经过1000余天成功获得了全球第一株&唯一一株反硝化型厌氧甲烷氧化菌的纯化培养物，首次证实了该菌独立介导的全程反硝化型厌氧甲烷氧化过程，并深入解析了该功能菌的微生物学机制。本研究丰富了对全球碳氮循环的认识，为水处理潜在工艺开发提供了科学支撑。

 第一作者简介

第一作者 姚翔午：浙江大学2023届博士研究生，现为浙江大学博士后，研究方向为甲烷和氮素的厌氧生物转化，发表SCI论文13篇，其中以第一作者身份在Nature Microbiology等国际知名期刊发表论文2篇，申请国家发明专利和实用新型专利各1项。

通讯作者简介

通讯作者 胡宝兰: 浙江大学求是特聘教授，博士生导师。主要从事环境微生物学和环境生物技术方面的研究工作。主持国家自然科学基金、国家重点研发课题、国家科技支撑计划、浙江省重点研发课题等纵向课题20多项，承担企业委托课题20余项；在“Nature Microbiology”、“Nature Communications”、“PNAS”、“Environmental Science & Technology”、“Water Research”等期刊上发表SCI论文144篇，ESI高引论文5篇，H=44，总他引次数5000余次。获省部以上奖项6项，参编著作/教材8本，授权国家专利50余项。    

作者：姚翔午   审核：胡宝兰